次氯酸鈣金黃色pu萄球菌滅活效果檢測(cè)技術(shù)規(guī)范與方法優(yōu)化研究

次氯酸鈣金黃色pu萄球菌滅活效果檢測(cè)技術(shù)規(guī)范與方法優(yōu)化研究  

一、檢測(cè)原理與標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)  

（一）殺菌機(jī)制  

次氯酸鈣溶于水釋放次氯酸（HClO），通過(guò)以下途徑殺滅金黃色pu萄球菌（StaphylococcusaureusATCC6538）：  

1.細(xì)胞膜破壞：HClO穿透細(xì)胞壁，氧化磷脂雙分子層；  

2.蛋白質(zhì)變性：與酶活性中心巰基（-SH）反應(yīng)，抑制代謝酶活性；  

3.DNA損傷：破壞核酸結(jié)構(gòu)，阻止細(xì)胞復(fù)制1。  

（二）標(biāo)準(zhǔn)方法  

國(guó)標(biāo)：GB/T27954-2020《消毒劑衛(wèi)生要求》懸液定量殺滅試驗(yàn)；  

國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)：EN13704《化學(xué)消毒劑和防腐劑食品、工業(yè)、家庭和公共區(qū)域用化學(xué)消毒劑殺菌活性評(píng)價(jià)》2。  

二、試驗(yàn)材料與試劑配制  

（一）菌株與培養(yǎng)基  

1.標(biāo)準(zhǔn)菌株：金黃色pu萄球菌ATCC6538，由中國(guó)普通微生物菌種保藏中心提供；  

2.培養(yǎng)基：營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA），pH7.0±0.2，121℃滅菌20分鐘1。  

（二）關(guān)鍵試劑  

1. 次氯酸鈣溶液：  

母液：稱取0.5g次氯酸鈣（有效氯65%），用無(wú)菌水溶解定容至100mL，有效氯濃度3250mg/L；  

工作液：用PBS稀釋至500mg/L（按殺滅要求調(diào)整）3。    

中和劑：  

0.1%硫代liu酸鈉（Na?S?O?）溶液，中和有效氯至＜0.1mg/L1。  

三、試驗(yàn)流程與操作規(guī)范  

（一）菌懸液制備  

1.活化培養(yǎng)：  

將凍干菌種接種至NA斜面，37℃培養(yǎng)18-24小時(shí)；  

挑取單菌落轉(zhuǎn)接至營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃振蕩培養(yǎng)6小時(shí)（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）。   

稀釋與干擾物添加：  

用0.03mol/LPBS（含10%小牛血清）稀釋菌液至1×10?CFU/mL；  

混勻后備用，2小時(shí)內(nèi)使用2。  

（二）殺滅試驗(yàn)步驟  

樣品處理：  

取5mL次氯酸鈣工作液（500mg/L）至滅菌試管，37℃水浴預(yù)熱5分鐘；  

加入5mL菌懸液（1×10?CFU/mL），立即計(jì)時(shí)并混勻。    

作用與終止：  

20℃±1℃避光作用10分鐘（按產(chǎn)品說(shuō)明書調(diào)整作用時(shí)間）；  

取1.0mL混合液至9.0mL中和劑，混勻后靜置10分鐘1。   

培養(yǎng)與計(jì)數(shù)：    

取中和后液體1.0mL，用PBS梯度稀釋（10?1-10?3）；  

各稀釋度取0.5mL傾注NA平板，37℃培養(yǎng)48小時(shí)，計(jì)數(shù)菌落數(shù)（CFU）2。  

（三）對(duì)照組設(shè)置  

對(duì)照組類型操作步驟作用  

陽(yáng)性對(duì)照組菌懸液+PBS（不加消毒劑）驗(yàn)證菌活性  

陰性對(duì)照組中和劑+培養(yǎng)基驗(yàn)證無(wú)菌操作  

中和劑對(duì)照組消毒劑+中和劑+菌懸液驗(yàn)證中和劑有效性  

四、結(jié)果計(jì)算與判定標(biāo)準(zhǔn)  

（一）殺滅率計(jì)算  

殺滅率（）  

符號(hào)說(shuō)明：  

試驗(yàn)組活菌數(shù)（CFU/mL）；  

陽(yáng)性對(duì)照組活菌數(shù)（CFU/mL）1。  

（二）判定標(biāo)準(zhǔn)  

產(chǎn)品類型作用時(shí)間（min）有效氯濃度（mg/L）殺滅率要求（%）  

物體表面消毒劑10500≥99.99  

手消毒劑1.51000≥99.999  

五、影響因素與優(yōu)化策略  

（一）關(guān)鍵因素控制  

因素優(yōu)化條件效果  

有效氯濃度500-1000mg/L（根據(jù)有機(jī)物調(diào)整）殺滅率提升至99.99%  

作用pH6.5-7.5（中性條件）HClO占比達(dá)80%以上  

溫度20-25℃溫度每升高10℃，殺滅時(shí)間縮短一半  

（二）常見問(wèn)題解決方案  

問(wèn)題現(xiàn)象原因分析解決措施  

殺滅率偏低有效氯濃度不足或中和劑過(guò)量重新標(biāo)定濃度，調(diào)整中和劑用量至9mL  

菌落蔓延菌懸液濃度過(guò)高增加稀釋梯度至10??  

中和劑失效硫代liu酸鈉氧化使用新鮮配制的中和劑  

六、質(zhì)量控制與應(yīng)用場(chǎng)景  

（一）質(zhì)控指標(biāo)  

1.菌懸液濃度：1×10?±0.5×10?CFU/mL；  

2.中和劑有效性：中和后殘留菌數(shù)≤10CFU/mL2。  

（二）典型應(yīng)用  

1.醫(yī)療環(huán)境表面：物體表面擦拭后殺滅率≥99.99%；  

2.食品加工設(shè)備：消毒后金黃色pu萄球菌殘留≤10CFU/cm21。  

關(guān)鍵詞：次氯酸鈣；金黃色pu萄球菌；殺滅率；懸液定量試驗(yàn)；GB/T27954  

參考文獻(xiàn)  

[1]GB/T27954-2020消毒劑衛(wèi)生要求[S].  

[2]EN13704化學(xué)消毒劑殺菌活性評(píng)價(jià)[S].  

[3]WHO飲用水消毒指南[S].